beta半乳糖苷酶活性测定

gaoch

2011-02-16

Categories: 旧文 WordPress博客 Tags: 原创教程 TUTORIAL 实验方法 METHODS 生物学 BIOLOGY

试验原理

如图所示，糖苷酶水解底物无色ONPG，生成黄色产物，通过测量吸光值，可以得出糖苷酶的活性。

所用试剂

Z buffer, per 50 mL:

    * O.80g Na2HPO4.7H2O (0.06M)
    * 0.28g NaH2PO4.H2O (0.04M)
    * 0.5 mL 1M KCl (0.01M)
    * 0.05 mL 1M MgSO4 (0.001M)
    * 0.135 mL b -mercaptoethanol (BME) (0.05M)
    * bring to approximately 40 mL with H2O, dissolve all the salts
    * adjust the pH to 7.0
    * use a graduated cylinder to bring the buffer to 50 mL
    * donot autoclave, store at 4 C.

ONPG
ONPG should be dissolved fresh each day. 可以溶于PBS，Z buffer或者水中。

PBS

Stop solution
1M Na2CO3

操作步骤

准备样品
将菌培养至稳定期（OD600约为2）
按照1:50的比例转接到新鲜培养基中（并按时间梯度依次取样）
样品离心后，用PBS冲洗，然后保存在-80摄氏度待用

测量酶活
将细胞用Z buffer重悬
然后超声破碎裂解细胞或者加入氯仿和SDS裂解
将生色底物 2-硝基苯-beta-D-半乳糖苷加入反应液中
在28摄氏度下孵育1小时
加入终止液（1M Na2CO3）终止反应
取溶液上清，测量420nM和550nM下的吸光度

计算过程
则糖苷酶活性（Miller单位）=（1000 X A420) / (time [min] X 样品体积 [ml] X A600)。
另外一种计算公式（使用550nM吸光值作为修正）
Miller Units =
1000 x [(OD420 – 1.75 x OD550)] / (T x V x
OD600)

  • OD420 and OD550 are
    read from the reaction mixture.
  • OD600 reflects cell density in
    the washed cell suspension.
  • T = time of the reaction in
    minutes.
  • V = volume of culture used in the assay in
    mLs.

The units give the change in A420/min/mL of
cells/OD600

Beta-Galactosidase Activity Assay. at <http://rothlab.ucdavis.edu/protocols/beta-galactosidase-3.html

作者简介

Chun-Hui Gao is a Research Associate at Huazhong Agricultural University.

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